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[文獻(xiàn)精讀] 如何鑒定游離DNA的身份

2017-08-24 00:00來(lái)源：原版作者：Jerry Li


 血液中的游離DNA（cfDNA）是液體活檢的首要關(guān)注點(diǎn)。 為了精準(zhǔn)檢測(cè)這些游離的DNA片段, 我們就需要關(guān)注游離DNA的基本特征，比如濃度、片段大小、序列、穩(wěn)定性等【1-4】。 但是更重要的問(wèn)題，是怎樣鑒定這些游離DNA的身份。 身份指導(dǎo)行為。 比如說(shuō)我們有了新同事或是新鄰居，好奇的我們首先想要知道新人的身份，從哪里來(lái)，以前做過(guò)什么，這樣基本可以預(yù)測(cè)這人的行為。根據(jù)同樣的思路，我們關(guān)注游離DNA的身份，即它們從哪里來(lái)，到哪里去， 哪些是靶向DNA, 哪些是干擾DNA, 哪些DNA在哪些生理環(huán)境下有哪些生物學(xué)行為。這些知識(shí)無(wú)疑會(huì)幫助我們?cè)O(shè)計(jì)更新更好的，來(lái)穩(wěn)定、保護(hù)和檢測(cè)游離DNA。

在液態(tài)活檢的科研領(lǐng)域，我們可以借助目前已經(jīng)建立了的模型，來(lái)總結(jié)游離DNA的行為特征，從而鑒定其身份。在這里我們重點(diǎn)討論血液凝集系統(tǒng)和創(chuàng)傷系統(tǒng)， 這兩個(gè)系統(tǒng)的特點(diǎn)是它們都有非常訊速變化的血液環(huán)境。 這樣的環(huán)境里， 游離DNA的水平處于顯著的動(dòng)態(tài)變化中，這就為我們提供了非常獨(dú)特和寶貴的視角，為我們闡釋了游離DNA身份提供了依據(jù)。

1．從血液凝集看游離DNA動(dòng)態(tài)變化

血漿和血清作為最常見(jiàn)的血液樣品，分別是采血系統(tǒng)的抗凝和促凝的產(chǎn)物，它們內(nèi)含的游離DNA的水平有很大差異【5-12】。 在配對(duì)對(duì)比試驗(yàn)中，科研人員對(duì)同一患者的血樣在其他條件都對(duì)等的條件下， 對(duì)比分析了血漿樣品和血清樣品，發(fā)現(xiàn)血清里的游離DNA的水平是血漿的14倍【5】到20倍【6】。 這里指的是新鮮血清和血漿的比對(duì)，如果觀察貯存的樣品，人們發(fā)現(xiàn)血清內(nèi)的游離DNA水平在穩(wěn)步上升， 在4°C的環(huán)境里保存5天的血清樣本，游離DNA的水平可以在本底基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高100倍，而同等條件下的血漿里游離DNA的水平基本不變【6】。

由于血清是血液凝集后的產(chǎn)物，一系列的級(jí)聯(lián)凝集反應(yīng)導(dǎo)致血小板富集，化學(xué)介質(zhì)釋放，核酸以及核酸酶釋放，這些都是導(dǎo)致血清中DNA水平的變化的可能原因。 我們已經(jīng)知道的是，血清中升高的DNA有相當(dāng)部分是來(lái)自白細(xì)胞中釋放的基因組DNA。 這些DNA不僅量很高，水平和化學(xué)性質(zhì)也很不穩(wěn)定【13-15】。 更重要的是，對(duì)于液體活檢項(xiàng)目中我們關(guān)注的靶分子，比如無(wú)創(chuàng)產(chǎn)檢中的胎兒DNA,  血清中的量反而比血漿中更少【16】。 這很可能來(lái)自于白細(xì)胞釋放的DNA酶對(duì)于游離DNA的降解作用。

2．血清不適合做液體活檢的樣品

液體活檢樣品的大忌就是（1）相關(guān)DNA的量小，（2）無(wú)關(guān)DNA的量大。 這兩點(diǎn)在血清中都體現(xiàn)出來(lái)了。 那么血清是否是不適合做液體活檢的樣品？ 我們來(lái)看看腫瘤監(jiān)測(cè)的情況，因?yàn)槟[瘤監(jiān)測(cè)相對(duì)于產(chǎn)檢、創(chuàng)傷監(jiān)測(cè)這些常規(guī)檢查，腫瘤監(jiān)測(cè)的難度更大，是液體活檢的終極挑戰(zhàn)。在【17】肺癌患者的血漿對(duì)血清的配對(duì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，血漿檢測(cè)可以看出患者的游離DNA的量顯著地高于健康人（24.5ng/mL vs 5.1ng/mL）, 而血清檢測(cè)的結(jié)果顯示肺癌患者和健康人的游離DNA水平是一樣的。 也就是說(shuō)，在液態(tài)活檢的高難度項(xiàng)目中，使用血漿是比血清能更有效地檢出腫瘤的存在。  液體活檢的樣品準(zhǔn)備對(duì)結(jié)果有直接影響，血清樣品因?yàn)槠涓咚降幕蚪MDNA以及核酸酶，給液體活檢的靶分子檢測(cè)提高了難度，因而不適合做液體活檢。

我們同時(shí)應(yīng)該看到，血液樣品中的游離DNA是處于動(dòng)態(tài)變化的， 即便是血漿樣品，它內(nèi)部的游離DNA水平也在穩(wěn)步提高。 同樣是血漿樣品，在常規(guī)采血管（比如EDTA管）中的游離DNA可能比特殊采血管（比如BCT）中高上百倍【18】。 所以對(duì)于液體活檢的樣品處理，使用細(xì)胞穩(wěn)定劑來(lái)穩(wěn)定血液細(xì)胞，是保護(hù)cfDNA是根本的解決辦法【19-23】。關(guān)于血細(xì)胞的穩(wěn)定和血液樣品貯存運(yùn)輸，可以參照我們的《液體活檢通訊-2017.6： 樣本處理對(duì)cfDNA和液體活檢的影響 》。  

3. 從創(chuàng)傷看游離DNA的消長(zhǎng)

如果說(shuō)血清樣品中游離DNA變化是局部的、人為促成的，那么創(chuàng)傷（trauma）過(guò)程中游離DNA變化則反映了整體的、有機(jī)的變化，所以能更加有信服力第說(shuō)明游離DNA的動(dòng)態(tài)和來(lái)源。 根據(jù)對(duì)創(chuàng)傷患者的檢測(cè)，患者血液中游離DNA的水平是無(wú)一例外是升高的【24-35】。 經(jīng)典的研究發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷發(fā)生的20分鐘內(nèi)，血液中游離DNA的水平就能夠被檢出有顯著升高【24】。如果患者的創(chuàng)傷情況在幾小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定下來(lái)，游離DNA的水平就會(huì)穩(wěn)定并開(kāi)始下降， 反之如果患者情況惡化并最終導(dǎo)致器官衰竭， 游離DNA的水平會(huì)持續(xù)保存在高點(diǎn)上，最長(zhǎng)的可以達(dá)到28天。根據(jù)創(chuàng)傷的種類(lèi)和嚴(yán)重程度， 游離DNA的水平也不同，所以游離DNA的水平是創(chuàng)傷預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。這些觀察涵蓋了多種創(chuàng)傷，包括外科手術(shù)、開(kāi)放性傷口、灼傷、化學(xué)燒傷等，這些創(chuàng)傷都看到了游離DNA水平的迅速升高。在2017年的一份綜述文章里， 人們列舉了14個(gè)針對(duì)創(chuàng)傷ICU的臨床研究，共計(jì)904名患者， 結(jié)論是在創(chuàng)傷病例中，高水平的游離DNA和高死亡率是顯著相關(guān)的【35】。

更多的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于創(chuàng)傷導(dǎo)致的肺損傷、呼吸壓力癥的患者，相對(duì)于最終沒(méi)有引發(fā)這些并發(fā)癥的患者，他們的游離DNA的水平要高12倍【25】。刺穿創(chuàng)傷的患者的游離DNA水平高于鈍擊創(chuàng)傷的患者，并發(fā)感染的患者的游離DNA水平高于比沒(méi)有感染的患者【26】。在創(chuàng)傷患者的系統(tǒng)里，不僅核源的游離DNA水平升高，線粒體DNA的水平也升高【28】。這些結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明，游離DNA和機(jī)體應(yīng)急狀態(tài)密切相關(guān)，和凝血過(guò)程密切相關(guān)。

4. 游離DNA參與機(jī)體防御和凝血

細(xì)胞的死亡，無(wú)論是正常細(xì)胞的凋亡，還是癌細(xì)胞的死亡，都會(huì)造成游離DNA的量增【35-40】。 加上人們對(duì)血液凝集過(guò)程以及創(chuàng)傷的觀察，很自然地推論出游離DNA的來(lái)源是細(xì)胞死亡造成的。 進(jìn)一步的推論很可能就是，游離DNA只是死亡細(xì)胞的釋放產(chǎn)物，雖然它有重要的示蹤作用，可以幫助鑒別癌細(xì)胞、胚胎細(xì)胞，但游離DNA是被動(dòng)的、沒(méi)有功能的細(xì)胞廢物， 在血樣中逐漸減少并消失呢， 實(shí)際情況是否是這樣呢？  實(shí)際情況總是復(fù)雜得多。

根據(jù)對(duì)血液白細(xì)胞和凝血的細(xì)致研究，人們發(fā)現(xiàn)游離DNA是中性粒胞外陷阱（neutrophil extracellular traps， 簡(jiǎn)稱(chēng)NET）的重要組成部分【41-51】 。 中性粒胞外陷阱是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的免疫防御系統(tǒng)，在外來(lái)病原體（比如細(xì)菌）或是免疫信號(hào)的刺激下，中性粒細(xì)胞會(huì)釋放出特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來(lái)纏在病原體，防止其擴(kuò)散和增生。 這個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就是中性粒胞外陷阱， 是由游離DNA、組蛋白和抗微生物蛋白組成的【41】。 沒(méi)有游離DNA就不會(huì)形成中性粒胞外陷阱， 如果用DNA酶來(lái)降解DNA會(huì)導(dǎo)致 中性粒胞外陷阱的失活。 這在客觀上解釋了為什么正常人，無(wú)論多么健康，都是有一定水平的游離DNA, 因?yàn)橛坞xDNA是機(jī)體防御的一部分。

對(duì)中性粒胞外陷阱的研究還發(fā)現(xiàn)， 這些網(wǎng)結(jié)構(gòu)可以刺激凝血和血栓的形成【42】。 在動(dòng)物模型里，人為提高游離DNA的水平，可以直接刺激凝血酶-抗血栓酶復(fù)合物的發(fā)生和增長(zhǎng)， 表明游離DNA很可能參與了某種凝血刺激信號(hào)。 在由病原體激活的全血樣品中，游離DNA的主要來(lái)源是中性粒細(xì)胞。 中性粒胞外陷阱在形成血栓后導(dǎo)致中性粒細(xì)胞死亡，同時(shí)釋放游離DNA。 這個(gè)過(guò)程不同于通過(guò)細(xì)胞凋亡來(lái)是否游離DNA，因?yàn)闆](méi)有它沒(méi)有導(dǎo)致DNA長(zhǎng)鏈的斷裂【44】。

我們知道凝血和血栓過(guò)程是機(jī)體自我保護(hù)的一種機(jī)制，但同時(shí)它在某些病理情況下也是對(duì)機(jī)體有傷害作用。無(wú)論是保護(hù)和傷害， 游離DNA參與凝血和血栓都說(shuō)明，游離DNA不只是被動(dòng)的、沒(méi)有功能的細(xì)胞成分， 而是細(xì)胞功能的一部分，是細(xì)胞的工具并可以被主動(dòng)調(diào)控。 至于游離DNA是怎樣被調(diào)控的，并用怎樣的機(jī)理來(lái)調(diào)控血凝和血栓，現(xiàn)在人們的知識(shí)還很有限。 隨著液體活檢領(lǐng)域的科研和臨床研究的展開(kāi)， 游離DNA在正常生理環(huán)境下的身份，一定會(huì)更加清晰。


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