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[文獻(xiàn)精讀] 液體活檢的發(fā)祥地和試驗田

2017-08-28 00:00來源：原版作者：Jerry Li

從最初人們發(fā)現(xiàn)游離的腫瘤DNA， 到2010年后臨床概念的建立和檢測技術(shù)的成熟，液體活檢的發(fā)展實際上經(jīng)過了很漫長的過程。 液體活檢的發(fā)展在很大程度上得益于無創(chuàng)產(chǎn)檢領(lǐng)域的發(fā)展。 無創(chuàng)產(chǎn)檢（NIPT）由于其在理論和實踐上都和腫瘤的液體活檢很相似，被認(rèn)為是液體活檢的一個分支。 從無創(chuàng)產(chǎn)檢在90年代末建立的那一刻開始， 就成為了液體活檢的發(fā)祥地和試驗田。

我們在上一期的《液體活檢通訊》中討論了用來研究和鑒定游離DNA的身份的兩個重要的模型系統(tǒng)， 即凝血系統(tǒng)和創(chuàng)傷系統(tǒng)。 這兩個系統(tǒng)都是訊速變化的血液環(huán)境， 在這樣的環(huán)境里的游離DNA的消長情況不僅提供了游離DNA的生物學(xué)指標(biāo)， 更為診斷患者的生理病理情況，比如創(chuàng)傷患者的預(yù)后， 提供了有力的依據(jù)。  這兩個系統(tǒng)都是同源系統(tǒng)，即增生的游離DNA和本底的游離DNA來自同一供體。

實際上，從科學(xué)發(fā)現(xiàn)的角度看，同源系統(tǒng)對于液體活檢的科研來說是有很大難度的， 因為同源系統(tǒng)中增生和變化的DNA是很難追溯的。 相形之下， 異源系統(tǒng)中追溯DNA要容易得多。 最經(jīng)典的異源系統(tǒng)就是母體和嬰兒， 無創(chuàng)產(chǎn)檢就是用母體血樣來鑒定嬰兒基因。 在這個系統(tǒng)中，異源的游離DNA在高分辨率的分子診斷方法學(xué)下，可以清晰地判斷出來。


無創(chuàng)產(chǎn)檢后來居上，引領(lǐng)液體活檢

液體活檢的主流市場和終極目標(biāo)，是通過游離DNA和游離細(xì)胞來完成對腫瘤的檢測。 在1996年發(fā)表在《自然醫(yī)學(xué)》的兩篇文章里， 美國和瑞士的兩個項目組分別獨立地構(gòu)建了檢測患者血液中的游離的腫瘤DNA的方法【1,2】。 其中的美國約翰霍普金斯大學(xué)的Sidransky項目組，他們研究了21位頭頸癌患者的血清， 發(fā)現(xiàn)了其中6位患者有衛(wèi)星DNA的突變， 這些突變和實體瘤的癌突變是一致的，而這6位患者都發(fā)生了癌癥轉(zhuǎn)移。

幾乎在與此同時，瑞士的植物生化和生理實驗室的Anker項目組，用肺癌患者的血漿為樣本，發(fā)現(xiàn)了在大于70%的樣本里可以檢測到載有腫瘤突變的游離DNA。 這兩篇文章為建立當(dāng)代液體活檢的方法學(xué)的提供了理論依據(jù)。從最初發(fā)現(xiàn)游離的腫瘤DNA【3】到這時建立了初步的方法學(xué)，20年已經(jīng)過去了， 腫瘤的液體活檢終于有了顯著的進(jìn)步，但是在展望的同時仍然有很多疑慮【4,5】。

在1996年《自然醫(yī)學(xué)》的這兩篇關(guān)于游離腫瘤DNA文章發(fā)表后，啟發(fā)了香港中文大學(xué)的盧煜明教授。 盧教授當(dāng)時剛剛建立了自己的獨立課題組，他抓住了這個機(jī)會，從而開啟了無創(chuàng)產(chǎn)檢的系統(tǒng)【6-8】。盧教授的邏輯也很明確， 嬰兒比腫瘤大多了，既然腫瘤的游離DNA可以檢測到，嬰兒的DNA就更能檢測到。

無創(chuàng)產(chǎn)檢領(lǐng)域的開創(chuàng)性文獻(xiàn)，是盧煜明于1997年在《柳葉刀》上發(fā)表的論文，闡述了在母體的血清和血漿中發(fā)現(xiàn)了嬰兒DNA【9】。 這篇文章里他研究了30位懷有男嬰的孕婦， 用PCR擴(kuò)增和檢測DNA, 發(fā)現(xiàn)其中的21位（70%）在她們的血樣里有Y染色體的DNA。 因為Y染色體是男性特征，只能來源于男嬰， 而在非懷孕婦女以及懷有女嬰的對照組樣品里沒有發(fā)現(xiàn)Y染色體DNA, 所以結(jié)論是母體血樣中有游離的嬰兒DNA, 這為無創(chuàng)產(chǎn)檢提供了理論依據(jù)。 這篇論文充分發(fā)揮了異源DNA系統(tǒng)的優(yōu)勢，大繁至簡， 用母體環(huán)境對照Y染色體這個直觀明了的追蹤系統(tǒng)， 迅速找到了目標(biāo)DNA。

無創(chuàng)產(chǎn)檢的系統(tǒng)和方法

無創(chuàng)產(chǎn)檢的主要臨床目標(biāo)，是通過母體血清中的游離的嬰兒DNA來檢測是嬰兒的染色體異?！?/span>10-14】。 其中最常見的是對唐氏綜合征的無創(chuàng)檢測【15-20】。 唐氏綜合征（Down syndrome）又被稱為21三體綜合征（trisomy 21）， 是最常見的嚴(yán)重出生缺陷病， 在美國有35萬唐氏綜合征的病人，而在全球范圍內(nèi)的唐氏的發(fā)病率和癥狀也都很相似。除了唐氏綜合征，還有其他的染色體異常， 包括13三體綜合征（trisomy 13, 又稱Patau Syndrome）， 18三體綜合征（trisomy 18, 又稱Edward Syndrome），特納綜合征 （Turner Syndrome， 又稱45,X）和較為罕見的全套染色體三體綜合征（Triploidy）。

對于這些染色體遺傳病的無創(chuàng)檢測， 已經(jīng)有了相當(dāng)?shù)呐R床病例積累【21-30】。 無創(chuàng)產(chǎn)檢的檢測方法主要是PCR和測序，包括大規(guī)模平行測序等二代測序方法【6-8， 31-33】。 從現(xiàn)有文獻(xiàn)提供的數(shù)據(jù)看， 無創(chuàng)產(chǎn)檢的系統(tǒng)和傳統(tǒng)方法相比， 除了風(fēng)險的降低， 它的檢出率（DR， detection rate）和假陽性率（FPR, false positive rate）也明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。 至此，無創(chuàng)產(chǎn)檢在安全性、靈敏度、特異性上全方位超越了傳統(tǒng)方法，已經(jīng)進(jìn)入了臨床診療指南【34-35】，成為主流的檢測方法?；跓o創(chuàng)產(chǎn)檢的檢測產(chǎn)品， 也陸續(xù)在法規(guī)上得到獲得批準(zhǔn)。

除了對染色體異常的檢測， 無創(chuàng)產(chǎn)檢的還提供了更前沿的產(chǎn)檢項目， 包括全基因組分析、全轉(zhuǎn)錄組分析、全甲基化組分析、組織來源分析等【36-39】。 這些前沿的雖然還是停留在研發(fā)階段， 沒有進(jìn)入法規(guī)， 但也引領(lǐng)了未來的無創(chuàng)產(chǎn)檢以致整個液體活檢的方向。

產(chǎn)檢是有標(biāo)準(zhǔn)答案的平臺

無創(chuàng)產(chǎn)檢為開發(fā)液體活檢的方法和產(chǎn)品，提供了一個完美的平臺。 這個平臺的最大的優(yōu)勢，在于這個平臺能夠提供標(biāo)準(zhǔn)答案。

在無創(chuàng)方法之前， 產(chǎn)檢是通過羊水穿刺或絨毛檢查來完成， 用這些傳統(tǒng)方法來檢測染色體異常，是有完整的方法學(xué)和大量的臨床積累的【40-46】。 這些傳統(tǒng)方法為無創(chuàng)方法提供了參照系，提供了標(biāo)準(zhǔn)答案。 產(chǎn)檢的標(biāo)準(zhǔn)答案是體現(xiàn)在這個幾個方面。

第一，明確的時間表；

第二，清楚定義的檢測目標(biāo)；

第三，異源系統(tǒng)。

無論是第一孕期還是第二孕期， 染色體異常的出現(xiàn)時機(jī)、概率、位點、游離DNA水平等， 都有明確的期待范圍【47-54】。 所以任何新的產(chǎn)檢方法， 包括已經(jīng)開發(fā)的無創(chuàng)檢測，還有未來的產(chǎn)檢方法， 只要和現(xiàn)有方法比對， 就可以計算出檢出率和假陽性率，相對準(zhǔn)確地對新方法的優(yōu)劣做出鑒別。 相當(dāng)來說，腫瘤的出現(xiàn)或者復(fù)發(fā)，沒有明確的時間表， 突變位點眾多， 它是沒有標(biāo)準(zhǔn)答案的， 如果要計算出檢出率等參數(shù)，其過程也更為復(fù)雜，這樣開發(fā)新檢測方法的成本和時間要求就更高。 作為異源系統(tǒng)， 產(chǎn)檢提供了明確而簡便的異源系統(tǒng)， 每一份嬰兒的DNA都有特征DNA(比如Y染色體DNA)， 而腫瘤的高度異質(zhì)性和突變率決定了它作為異源系統(tǒng)，是非常復(fù)雜的。 可以這樣認(rèn)為，如果沒有無創(chuàng)產(chǎn)檢在近年的技術(shù)推動， 液體活檢領(lǐng)域到現(xiàn)在還只能是在黑暗中充滿希望地摸索著。

綜合地看， 無創(chuàng)產(chǎn)檢作為液體活檢的先行領(lǐng)域，開創(chuàng)了重要的概念和方法學(xué)， 對液體活檢的整個領(lǐng)域做出了非常積極的推動作用。 從市場規(guī)模和未來發(fā)展前景看，產(chǎn)檢只是液體活檢的一個很小的部分，但是它作為液體活檢的試驗田的在未來將持續(xù)發(fā)揮重要作用。


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