原文出處

Transl Lung Cancer Res 2016;5(6):665-672

 

作者

Clara Pérez-Barrios¹*, Irene Nieto-Alcolado²*, María Torrente³, Carolina Jiménez-Sánchez², Virginia Calvo³, Lourdes Gutierrez-Sanz³, Magda Palka³, Encarnación Donoso-Navarro¹, Mariano Provencio³, Atocha Romero^2,3

摘要

背景：在癌癥患者中實(shí)施用于生物標(biāo)志物檢測(cè)和對(duì)治療監(jiān)測(cè)的反應(yīng)的液體活檢可能增加實(shí)驗(yàn)室的通過量，需要開發(fā)用于循環(huán)游離DNA（cfDNA）分離的自動(dòng)化方法。

方法：本研究比較了MagNA Pure Compact（MPC）核酸分離試劑盒I和Maxwell®RSC（MR）ccfDNA等離子體試劑盒，后來與QIAamp循環(huán)核酸（QCNA）試劑盒比較，使用57例來自癌癥患者的血漿樣品。使用Qubit熒光計(jì)測(cè)量cfDNA濃度。使用Agilent 2100生物分析儀評(píng)估DNA片段長(zhǎng)度。循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）通過數(shù)字PCR（dPCR）定量。

 

結(jié)果：首先，我們觀察到MPC方法比MR顯著提取較少的cfDNA（P <0.0001）。然而，QCNA和MR試劑盒的提取率沒有顯著差異。 cfDNA分離產(chǎn)量也與腫瘤分期相關(guān)，但與腫瘤位置無(wú)關(guān)。其次，在88％的樣品中觀察到寡核苷酸DNA梯形圖，在MPC和MR方法之間觀察到單，二和三核小體DNA片段的回收率的顯著差異。最后，使用數(shù)字PCR對(duì)38個(gè)配對(duì)樣品進(jìn)行了對(duì)cfDNA的腫瘤突變定量。配對(duì)樣本之間的突變等位基因級(jí)分（MAF）沒有顯著差異。

結(jié)論：分離cfDNA的方法可以影響DNA產(chǎn)量和分子量分?jǐn)?shù)的恢復(fù)。對(duì)于常規(guī)臨床實(shí)踐中的cfDNA分析，應(yīng)考慮這些觀察結(jié)果。

關(guān)鍵字：癌癥; 循環(huán)游離DNA（cfDNA）;表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）; KRAS

前言

 

全球癌癥是發(fā)病和死亡的主要原因之一。多年來，癌癥的發(fā)病率有所增加，這一趨勢(shì)預(yù)計(jì)在不久的將來會(huì)上升（1-3）。理解癌癥發(fā)展的生物學(xué)過程的最新突破已經(jīng)導(dǎo)致更有效的治療策略和靶向治療不可逆轉(zhuǎn)地改變了癌癥患者的治療。然而，使用這種療法需要在腫瘤活檢中進(jìn)行生物標(biāo)志物測(cè)試，并獲得足夠量的腫瘤材料用于分析可靶向基因中的體細(xì)胞突變是有些挑戰(zhàn)的。

 

由腫瘤細(xì)胞釋放的循環(huán)游離DNA（cfDNA）保留了原始組織的特征。因此，其研究允許通過非侵入性程序?qū)δ[瘤的遺傳表征，并解決常規(guī)活檢的困難（4-6）。此外，與固體活組織檢查不同，在液體活檢中，循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）可以在治療過程中進(jìn)行定量，這可能有助于測(cè)量腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)（7,8）。在這種情況下，要測(cè)試的樣本數(shù)量有望大幅增加，因?yàn)殚_發(fā)高通量技術(shù)可以使cfDNA分離成為重要的挑戰(zhàn)。以這種方式，自動(dòng)化系統(tǒng)的出現(xiàn)可以提高過程的重復(fù)性和魯棒性，并有助于在臨床環(huán)境中實(shí)施液體活檢。

本研究的目的是比較兩個(gè)自動(dòng)系統(tǒng)的cfDNA分離的性能，即MagNA Pure Compact（MPC）核酸分離試劑盒I（Roche Diagnostics，Penzberg，Germany）和Maxwell®RSC（MR）ccfDNA等離子體試劑盒（Promega Corporation，Madison，WI，USA），后者與QIAamp循環(huán)核酸）Kit（QIAgen，Valencia，CA，USA）手動(dòng)提取試劑盒，這是最廣泛的用于cfDNA分離的方法之一。具體來說，我們比較了獲得的核酸的cfDNA提取產(chǎn)率和片段大小。最后，我們通過比較來自具有驅(qū)動(dòng)突變的腫瘤患者的38個(gè)cfDNA樣品中的突變等位基因分?jǐn)?shù)（MAF）測(cè)量通過數(shù)字PCR（dPCR）來檢查腫瘤特異性突變的鑒定是否可受cfDNA分離方法的影響。

 

方法 

樣本人群

癌癥患者共獲得57份樣本，并在簽署了適當(dāng)?shù)闹橥鈺笥?015年2月至6月期間進(jìn)行了研究。該研究由醫(yī)院普埃爾塔德耶羅倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。該隊(duì)列由成年男性和女性診斷患有肺癌或結(jié)腸癌，臨床III-IV期（表S1）。從臨床和病理報(bào)告中獲得有關(guān)人口統(tǒng)計(jì)學(xué)，臨床病理特征和腫瘤突變狀態(tài)的信息。

 

實(shí)驗(yàn)方法

我們將57個(gè)周邊全血樣品收集在含有凝膠屏障的4mL PPT TM管（Becton Dickinson）中，以離心分離血漿。所有樣品在抽血時(shí)間后2小時(shí)內(nèi)在室溫下處理。在4℃下以1,500g離心10分鐘，將細(xì)胞級(jí)分與血漿分離。離心后，將55個(gè)血漿樣品分成兩等份1mL，將兩個(gè)血漿樣品分成3份等份1mL（圖S1）。將等分試樣在-80℃下立即儲(chǔ)存直到cfDNA提取。棄去溶血樣品進(jìn)行進(jìn)一步分析。在進(jìn)行cfDNA提取的同時(shí)，樣品在4℃的冰箱中解凍。解凍后，以5,000g進(jìn)行新的離心20分鐘，以確保除去上清液中的雜質(zhì)。

對(duì)于cfDNA分離方法比較，通過MR和QCNA處理31個(gè)樣品，通過MPC和MR處理24個(gè)樣品，并將兩個(gè)血漿樣品等分成三個(gè)并通過所有三種方法進(jìn)行處理（圖S1）。使用MR儀器（Promega），使用制造商規(guī)定的MR ccfDNA等離子體試劑盒分離cfDNA，并根據(jù)制造商的說明書使用QCNA試劑盒（QIAgen），并遵循“1mL無(wú)細(xì)胞DNA定制”程序（除了當(dāng)?shù)鞍酌窴孵育過夜），并在MPC儀器（Roche Diagnostics）上使用MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I。

 

在所有情況下，使用起始體積1mL的血漿提取cfDNA，并在50μL所提供的洗脫緩沖液中洗脫。根據(jù)制造商的說明書，使用Qubit dsDNA HS Assay試劑盒（Invitrogen，Life Technologies，CA，USA）在Qubit 2.0熒光計(jì)（Invitrogen，Life Technologies，CA，USA）上測(cè)量cfDNA濃度。

 

基于制造商推薦的方案，使用Agilent 2100生物分析儀和高靈敏度DNA芯片（Agilent Technologies Inc.，Palo Alto，CA，USA）進(jìn)行微流控電泳，以評(píng)估50至7,000個(gè)堿基對(duì)（bp）之間的DNA片段長(zhǎng)度。通過dPCR分析cfDNA樣品，使用EGFR p.T790M（AHRSROS），p.L858R（AHRSRSV）和p.E746_A750delELREA（AHLJ0XO）中以下突變的罕見突變測(cè)定法進(jìn)行分析。和突變?cè)赒uantas 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，South San Francisco，CA，USA）的KRAS中的p.G12V（AHX1IHY），p.G12D（AH6R5PI）和p.G13D（AHD2BW0）。對(duì)于dPCR，將8μL模板cfDNA與20μL反應(yīng)體積中的0.5μL上述40×TaqMan測(cè)定和10μL的2×QuantStudio 3D Master Mix混合。隨后，將15μL加載到QuantStudio 3D Digital PCR 20K芯片中。循環(huán)條件如下：96℃初始變性10分鐘，56℃2分鐘40個(gè)循環(huán)，98℃30秒，72℃10分鐘，最終樣品維持在22℃至少30分鐘。芯片熒光讀取兩次。使用QuantStudio®3D Analysis Suite?云軟件分析結(jié)果。需要時(shí)，手動(dòng)調(diào)整每個(gè)數(shù)據(jù)集群的自動(dòng)呼叫分配。測(cè)定結(jié)果報(bào)告為突變型DNA分子相對(duì)于突變體和野生型（wt）DNA分子總和的比例。每次運(yùn)行都包含了wt對(duì)照DNA。

 

統(tǒng)計(jì)分析

定性變量通過其頻率分布和定量變量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）或中位數(shù)和四分位數(shù)范圍進(jìn)行歸納總結(jié)。使用不同方法使用相同血漿樣品的不同等分試樣的cfDNA濃度產(chǎn)率的非參數(shù)比較使用配對(duì)數(shù)據(jù)的Wilcoxon有符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行不同臨床情況（例如腫瘤來源（肺癌對(duì)結(jié)腸直腸癌）或腫瘤分期（IV期與其他）的不同臨床情況的cfDNA濃度產(chǎn)率的非參數(shù)比較。分類變量之間的關(guān)聯(lián)通過McNemar's Test測(cè)試?？占僭O(shè)被小于0.05的I型誤差拒絕。

 

循環(huán)游離核小體結(jié)合DNA片段的相對(duì)定量表達(dá)為特定片段的濃度與相應(yīng)樣品中cfDNA的總濃度之間的比例。使用不同方法在配對(duì)樣品中獲得的循環(huán)游離核小體結(jié)合的DNA片段比例之間的比較通過Wilcoxon signrank測(cè)試來評(píng)估配對(duì)數(shù)據(jù)。對(duì)于這一分析，根據(jù)多次比較的Bonferroni校正，將顯著性水平調(diào)整為0.0083。 統(tǒng)計(jì)分析采用STATA 9.0 SE進(jìn)行。

 

結(jié)果

根據(jù)方法提取的cfDNA產(chǎn)量的比

     研究中包括的人群主要是白種人（95％），年齡從41歲到82歲。在收集的57個(gè)血漿樣本中，47個(gè)樣品對(duì)應(yīng)于肺癌患者，10個(gè)樣品對(duì)應(yīng)于結(jié)腸直腸癌?？偣矞y(cè)量了從57個(gè)血漿樣品獲得的總共116個(gè)樣品中的cfDNA濃度?？傮w而言，定量結(jié)果顯示癌癥患者血漿中的cfDNA濃度范圍在0.2至24ng /μL之間。

 

   為了比較，通過MR和QCNA從33個(gè)血漿樣品中提取cfDNA。該子集樣品來自肺癌患者，臨床III-IV期，除了一個(gè)與診斷為結(jié)腸直腸癌的患者相對(duì)應(yīng)的樣品外。根據(jù)我們的結(jié)果，通過MR方法提取的樣品的中值濃度為1.25 ng /μL，QCNA方法提取的樣品為1.08 ng /μL，方法之間的產(chǎn)量提取沒有顯著差異（P = 0.775）。有趣的是，我們觀察到，與非轉(zhuǎn)移患者相比，從IV期癌癥患者獲得的cfDNA的量顯著更高。對(duì)于使用MR和QCNA方法分離的cfDNA樣品，這是正確的（P = 0.045和P = 0.0173）。關(guān)于MR和MPC方法的比較，使用兩種方法處理了26個(gè)血漿樣品。這些血漿樣品來自IV期結(jié)直腸癌患者和轉(zhuǎn)移性疾病的肺癌患者，除了一名IIIA期患者。有趣的是，我們的數(shù)據(jù)顯示，MPC提取的顯著少于MR（1.154 vs. 2.31; P <0.0001）。我們還調(diào)查腫瘤位置（肺或結(jié)腸）是否可以影響cfDNA分離產(chǎn)率。我們的數(shù)據(jù)表明，通過MPC或MR方法處理的樣品中，根據(jù)腫瘤定位，cfDNA產(chǎn)量沒有顯著性差異（P = 0.9355和0.4834）。

根據(jù)方法比較循環(huán)游離核小體結(jié)合DNA片段分布

    以生物分析儀2100的方式，對(duì)從MR和QCNA提取的22個(gè)血漿樣品中獲得的44個(gè)cfDNA樣品和通過MR和MPC方法提取的17個(gè)血漿樣品獲得的34個(gè)cfDNA樣品進(jìn)行了分析。

    觀察到的cfDNA片段的大小為約180bp（平均182bp，范圍為151-205bp）。在78個(gè)cfDNA樣品中的69個(gè)中，我們還觀察到寡核苷酸DNA梯形圖，因?yàn)樵陔娪緶y(cè)定（圖1）中清楚地觀察到對(duì)應(yīng)于單，二和三核小體的峰的存在，表明凋亡細(xì)胞死亡。我們還檢測(cè)到78個(gè)cfDNA樣品中的54個(gè)中的高分子量（> 10,000bp）DNA片段，其可以源于通過壞死死亡的細(xì)胞。 

   此外，寡核苷酸片段的比例根據(jù)提取方法而變化（表1）。值得注意的是，通過MPC方法提取的大小為150?200bp的cfDNA片段的比例顯著高于MR法（P = 0.0005），而與MPC提取的二核苷酸和三核苷酸結(jié)合的cfDNA比例顯著低于（P = 0.0024和P = 0.0038）。

圖2: 通過MPC和MR方法提取的配對(duì)cfDNA樣品上腫瘤突變定量的代表性散點(diǎn)圖。 （A）患者MMM-96，p.E746_A750delELREA突變用FAM（藍(lán)色數(shù)據(jù)點(diǎn)）標(biāo)記，而野生型cfDNA用VIC（紅色數(shù)據(jù)點(diǎn)）標(biāo)記; （B）患者JMF-87，p.T790M突變用FAM標(biāo)記，野生型cfDNA用VIC標(biāo)記。 cfDNA，循環(huán)游離DNA; MPC，MagNA Pure Compact; MR，Maxwell®RSC。

提取方法對(duì)腫瘤突變分析的影響

     

    病理報(bào)告顯示，在57例中，F(xiàn)FPE樣本中有26例發(fā)生藥物改變。其中17例對(duì)應(yīng)于肺癌腫瘤中發(fā)現(xiàn)的EGFR突變，9例對(duì)應(yīng)于結(jié)腸直腸腫瘤中發(fā)現(xiàn)的KRAS突變。在相應(yīng)FFPE樣品中發(fā)現(xiàn)可藥用突變的26例患者中，我們能夠使用dPCR檢測(cè)從19個(gè)血漿樣品中分離的38個(gè)配對(duì)cfDNA樣品中鑒定出的變化。在圖2中顯示了用于成對(duì)的cfDNA樣品的腫瘤突變定量的代表性圖。在剩余的在cfDNA上沒有檢測(cè)到腫瘤改變的情況下，在治療期間提取血液樣品，并且診斷患者具有部分應(yīng)答或完全響應(yīng)到RECIST v1.1標(biāo)準(zhǔn)。

     

     在上述38個(gè)cfDNA樣品中，30個(gè)對(duì)應(yīng)于通過MR和MPC平行提取的15個(gè)血漿樣品中配對(duì)的cfDNA樣品。定義為突變體DNA拷貝相對(duì)于突變體和wt DNA拷貝的總和的比例的MAF及其所有分析樣品的置信區(qū)間如表2所示。如圖所示，平均來說，MAF在用MR和MPC，根據(jù)方法對(duì)cfDNA的腫瘤突變定量沒有顯著性差異（P = 0.8647），表明提取方法對(duì)cfDNA突變分析的影響較小。

    

     最后，分析了MR和QCNA從四個(gè)血漿樣品中分離出的8個(gè)cfDNA配對(duì)樣品進(jìn)行腫瘤突變檢測(cè)和定量（表3）。如先前觀察到的，配對(duì)cfDNA樣品之間的MAF相似。

討論

越來越多的證據(jù)支持在血液來源的樣品如cfDNA（9-11）中可以有效檢測(cè)腫瘤突變。此外，采集的相對(duì)容易程度和微創(chuàng)性質(zhì)使得cfDNA成為縱向監(jiān)測(cè)癌癥疾病和對(duì)治療反應(yīng)的有吸引力的臨床分析物（7,8）。因此，預(yù)期臨床實(shí)驗(yàn)室將管理的“液體”樣本數(shù)量將顯著高于FFPE樣本。在這種情況下，開發(fā)用于cfDNA隔離的自動(dòng)化系統(tǒng)是一個(gè)重要的需要解決的問題。然而，提取階段對(duì)于確保可靠的結(jié)果至關(guān)重要。值得注意的是，cfDNA具有一些特殊性，因?yàn)樗鼈兛梢陨羁痰赜绊懱崛‘a(chǎn)率和下游應(yīng)用。也就是說，cfDNA濃度通常很低，而且cfDNA高度片段化，其具有約180bp的短峰片段，其倍數(shù)似乎對(duì)應(yīng)于核小體DNA（12,13）。

 

幾項(xiàng)研究比較了不同的提取方法，用于分離血清/血漿樣本中的cfDNA，確實(shí)證明提取方法可以顯著影響cfDNA的產(chǎn)量（14-17）。類似地，我們觀察到MPC和MR提取方法在血漿樣品中的cfDNA回收率顯示出顯著差異（P <0.0001）。在比較QCNA試劑盒和MR時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)后者在cfDNA產(chǎn)量方面并不優(yōu)于前者，但由于它是一種自動(dòng)化方法，它更簡(jiǎn)單和更快速。據(jù)我們所知，上述方法比較在文獻(xiàn)中以前沒有報(bào)道過。此外，我們的結(jié)果表明，測(cè)試的試劑盒顯示單，二核小體DNA片段的恢復(fù)顯著不同（表1）。應(yīng)該在更大尺寸的隊(duì)列中驗(yàn)證該觀察結(jié)果，因?yàn)橐呀?jīng)表明低分子量的cfDNA部分經(jīng)常表現(xiàn)出指示腫瘤衍生的DNA的遺傳畸變（17,18）。

 

如前所述（5），與非轉(zhuǎn)移患者相比，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性疾病患者血漿中的cfDNA水平顯著升高。此外，我們已經(jīng)觀察到，在死亡患者中，cfDNA濃度隨疾病進(jìn)程特別高而增加（數(shù)據(jù)未顯示）。平行地，已經(jīng)描述了與健康個(gè)體相比，循環(huán)核小體在癌癥患者中的濃度高得多（19-21）。有趣的是，據(jù)報(bào)道，在各種腫瘤類型中，肺癌與循環(huán)核小體的最高值相關(guān)（19,20）。類似地，我們?cè)诖蠖鄶?shù)分析的樣品中觀察到寡核苷酸DNA梯形圖（88％）。

 

核小體釋放到循環(huán)中的機(jī)制被認(rèn)為是由靶向治療如酪氨酸激酶抑制劑誘導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞死亡（22,23）。當(dāng)追蹤靶向治療監(jiān)測(cè)的cfDNA突變時(shí)，應(yīng)考慮此信息。如果通過不同程序分離cfDNA可以影響更短和更長(zhǎng)的cfDNA片段的恢復(fù)，則腫瘤突變定量可能受到提取方法的影響是合理的。然而，根據(jù)cfDNA提取方法，我們沒有發(fā)現(xiàn)MAF的顯著差異。這可能部分是由于分析的樣本數(shù)量較少，更大尺寸的隊(duì)列將是特別有意義的，以澄清這個(gè)問題。值得注意的是，在一個(gè)樣品（表2中的RTS-12）中，我們無(wú)法檢測(cè)到由MR分離的cfDNA中的藥物改變，但在MPC提取的cfDNA中檢測(cè)到。如上所述，已經(jīng)表明，cfDNA的低分子量級(jí)分富集在腫瘤DNA中（18,19）。根據(jù)我們的研究結(jié)果，雖然整個(gè)cfDNA提取產(chǎn)量顯著較低（P <0.0001），MPC方法大小從150至200bp的cfDNA片段的回收率顯著高于MR法（P = 0.0005）。這可以至少部分解釋觀察到的差異。 

結(jié)論

在本文中我們證明，根據(jù)評(píng)估的方法，cfDNA提取產(chǎn)率和高分子量和低分子量cfDNA級(jí)分回收率有顯著差異。需要更大的研究來評(píng)估這些差異對(duì)下游應(yīng)用的影響，例如用于靶向治療監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物測(cè)試或腫瘤突變跟蹤。

  

致謝

作者希望感謝參與本研究的所有患者。

資助：本研究由西班牙科學(xué)與創(chuàng)新部衛(wèi)生研究所卡洛斯三世和歐洲區(qū)域發(fā)展基金（撥款編號(hào)：PI13 / 01806和PIE14 / 00064）支持，羅梅羅由瓊·羅德斯獎(jiǎng)學(xué)金支持（授權(quán)號(hào)： JR14 / 00017）和CP博士前研究由JoseLuísCasta?o基金會(huì)支持。

 

腳注

利益沖突：作者沒有任何利益沖突聲明。

道德聲明：該研究由醫(yī)院普埃爾塔耶羅倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：內(nèi)部代碼PI / 144-14）。病人獲得書面知情同意書。

 

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