針對具有活性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的功能性研究

原文出處

Clinical Chemistry 62:2

作者

Klaus Pantel and Catherine Alix-Panabie

作者信息

* Address correspondence to this author at: Laboratory of Rare Human Circulating Cells, Department of Cellular and Tissue Biopathology of Tumors, Institut Universitaire de Recherche Clinique, 641, avenue du Doyen Gaston Giraud, 34093 Montpellier Cedex 5, France. Fax +33-4-11-75-99-33; e-mail c-panabieres@chu-montpellier.fr. Hamburg, Germany; 2 Laboratory of Rare Human Circulating Cells, Department of Cellular and Tissue Biopathology of Tumors, University Medical Centre, Montpellier, France; 3 EA2415—Help for Personalized Decision: Methodological Aspects, University Institute of Clinical Research, Montpellier University, Montpellier, France.

摘要

背景：針對循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）這種新型的生物標(biāo)志物的研究在過去十年中受到高度關(guān)注。特別重要的是，以捕獲和分析CTC為特征的液體活檢提供了非侵入性的組織活檢的可能性，這在癌癥診斷中具有明顯的意義。

內(nèi)容：本篇綜述的重點是描述和討論如何對有活性的CTC的功能研究可以擴大液體活檢的應(yīng)用范圍，重點是乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和肺癌， 這些都是工業(yè)化國家的主要癌癥。大多數(shù)癌癥患者的外周血中CTC的數(shù)量較少， 這使得CTC的體外培養(yǎng)變得具有挑戰(zhàn)性。上皮腫瘤細(xì)胞難以培養(yǎng)，甚至在數(shù)百萬腫瘤細(xì)胞開始時也是如此。最近，幾個課題組已經(jīng)在具有較高量的CTC的非常晚期的癌癥患者體外和體內(nèi)擴增CTCs方面取得了重要進展。在這里，我們提供目前的技術(shù)來富集和檢測有活性的人類CTC，包括基于抗原表達和物理性質(zhì)的陽性和陰性富集策略。我們還討論了關(guān)于使用體外和體內(nèi)模型的CTC功能研究的公開數(shù)據(jù)。

結(jié)論：對CTC的功能分析提供了識別轉(zhuǎn)移細(xì)胞的生物學(xué)特性的可能性，包括確定轉(zhuǎn)移起始細(xì)胞。此外，從CTC衍生的細(xì)胞系和異種移植物可能會揭示新的治療靶點，可用于藥物篩選。

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背景介紹

      在過去十年中的許多研究表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）的計數(shù)在各種腫瘤實體中具有預(yù)后價值（1,2）。大多數(shù)研究涉及到最常見的上皮腫瘤、如乳腺癌、前列腺癌或肺癌; 這些腫瘤類型也是本篇綜述的重點。五年前，我們將CTCs的捕獲和分析介紹為“液體活檢”（3），這一概念受到了極大的關(guān)注。通過簡單的血液檢查來避免侵入性組織活檢和獲得相似或甚至增加的信息的可能性在癌癥診斷中具有巨大的意義。

      盡管許多新的CTC捕獲裝置（1）的發(fā)展和大量臨床研究表明，在具有定義療法的大型多中心隊列研究（4-6）中，CTC計數(shù)與臨床結(jié)果之間存在強相關(guān)性，但是有關(guān)CTC的功能特性的信息是仍然非常有限，因為CTC在癌癥患者的外周血中以非常低的濃度發(fā)生（1）。因此，功能分析的先決條件是我們在體外培養(yǎng)CTC的能力的最近進展，或通過使用異種移植物來用體內(nèi)擴增的辦法來增加CTC的總量。

      在這里，我們描述如何豐富和檢測可行的人類CTC，并通過使用體外和體內(nèi)模型討論功能研究。除了解決癌癥患者轉(zhuǎn)移生物學(xué)外，這些研究可以提供未來的重要臨床信息，包括用于癌癥患者個性化治療的抗轉(zhuǎn)移藥物的檢測。

富集和檢測有活性的CTC的策略

      通過增加CTC濃度的濃縮步驟可以更容易地檢測單個CTC。為了在濃縮和檢測功能性CTC期間使腫瘤細(xì)胞處于可行狀態(tài)，需要（a）在沒有固定劑的管中進行抽血，（b）快速（24小時）將血液樣品運送到實驗室，（c）快速分離和檢測透化，（d）在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下。我們將討論目前CTC測定在捕獲可行CTC的能力方面的潛力和局限性，用于后續(xù)分析。

富集有活性CTC的三類方法

1. 基于蛋白質(zhì)表達的技術(shù)。細(xì)胞表面蛋白可用于基于抗體的富集步驟以附著CTC。通過使用上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）進行陽性選擇，上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）是最常用于上皮CTC陽性富集的細(xì)胞表面標(biāo)記物。鑒于腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力，CTC的捕獲可能不僅僅依賴于EpCAM表達，而可能需要額外的靶點（例如表皮生長因子受體（EGFR），人表皮生長因子受體2（HER2），粘蛋白1（MUC1）]（7,8）。顯然，不能使用細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，因為細(xì)胞必須保持完整。不同的技術(shù)已被用于陽性選擇，包括免疫磁性分離或基于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞分選（7）。如果使用免疫磁性分離，重要的是珠不會損害細(xì)胞活力。如果流式細(xì)胞分選遵循免疫分離，珠的大小也可能是限制。需要進行高速流分選以實現(xiàn)CTC的快速隔離，并避免細(xì)胞活力喪失。

      陽性選擇的缺點是，為了選擇合適的抗體，必須假設(shè)捕獲抗原的細(xì)胞表面表達。腫瘤異質(zhì)性是癌癥的標(biāo)志;因此，預(yù)測在個體患者中在CTC上表達的合適的捕獲抗原的光譜是非常困難的（如果不是不可能的話）。為了規(guī)避這個問題，使用相反的策略可能是有吸引力的：通過陰性選擇來消除白細(xì)胞，通過使用在健康造血細(xì)胞而不是癌或其他實體瘤上表達的CD45。陰性選擇通常導(dǎo)致CTC的純度低于陽性選擇，但這并不是后續(xù)功能研究的嚴(yán)重缺點，因為污染性白細(xì)胞通常不會干擾細(xì)胞培養(yǎng)或異種移植物測定。陰性選擇技術(shù)的實例是白細(xì)胞的免疫磁性消耗或使用與紅細(xì)胞和白細(xì)胞反應(yīng)的抗體的復(fù)合物，然后把復(fù)合物導(dǎo)致通過使用Ficoll梯度離心（9-11）除去。

2. 物理性質(zhì)的技術(shù)。豐富CTC的另一種方法是按照與白細(xì)胞不同的物理特性對其進行排序：實際上，腫瘤細(xì)胞最初被認(rèn)為比白細(xì)胞更大，更不易變形。然而，最近的CTC研究表明存在小的CTC，甚至可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)移進展（12）。

鄭等人報道了可以豐富可行CTC的新型三維（3D）微型過濾器裝置（13）。該裝置由2層具有孔隙的Parylene膜和用光刻精確定義的間隙組成。

孔的位置在頂部和底部膜之間移動。底部膜支持捕獲的細(xì)胞，使細(xì)胞膜上的應(yīng)力集中最小化，并在過濾期間維持細(xì)胞活力。通過掃描電子顯微鏡，共聚焦顯微鏡和免疫熒光染色，通過使用摻入血液或鹽水的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的模型系統(tǒng)研究該裝置的活細(xì)胞捕獲。

      最近，Zhou等提出了一種可分離的雙層（SB）微型過濾器，用于可行的基于尺寸的CTC捕獲（14）。與其他單層CTC微型過濾器不同，2層之間的精確間隙和孔對準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致CTC的機械應(yīng)力急劇下降。隨著多種癌細(xì)胞株在健康供體血液中的摻入，SB微濾膜顯示出高捕獲效率（78％-83％），細(xì)胞活力保留率高（71％-74％），高腫瘤細(xì)胞富集（1.7-2103）和廣泛的建立培養(yǎng)文化的能力（100％的細(xì)胞系測試）。在轉(zhuǎn)移性小鼠模型中，SB微濾器成功地從0.4-0.6mL全血中富集可行的小鼠CTC，并允許建立體外培養(yǎng)用于進一步的遺傳和功能分析。

      Harouaka等設(shè)計了一種靈活的微彈性陣列裝置，用于富集活的CTC，與抗原表達無關(guān)（15）。與以前的微量過濾裝置不同，微量元件的柔性結(jié)構(gòu)使細(xì)胞損傷最小化，以保持生存力，同時最大限度地提高生產(chǎn)量，并允許直接從全血中快速富集，無需樣品預(yù)處理。 CTC和CTC微團簇從從乳腺癌，肺癌和結(jié)腸直腸癌患者獲得的臨床樣品中富集。該裝置在0.5-cm 2裝置上在10分鐘內(nèi)從7.5mL全血樣品中富集90％捕獲效率，104倍富集和80％存活力的腫瘤細(xì)胞。

      獨立于富集方法，對于隨后的功能測定，細(xì)胞既不是固定的也不是透化的，并且它們可以容易地從裝置中去除而沒有任何損害是至關(guān)重要的。

3. 基于CTC功能的技術(shù)。 CTC的功能特性也可用于其富集。大約10年前描述了第一個測定法，并且基于腫瘤細(xì)胞在體外侵入膠原基質(zhì)的能力。該測定已被用于卵巢和前列腺癌中CTC的計數(shù)和分子表征（16,17），但據(jù)我們所知，其培養(yǎng)CTC的效率仍有待證明。

最近，King和同事探討了腫瘤細(xì)胞粘附于血管以捕獲CTC的機制（18,19）。他們開發(fā)了微量流量裝置，除了具有抗上皮標(biāo)記的抗體外，還包括用E-選擇素糖蛋白功能化的表面。該裝置已成功用于從轉(zhuǎn)移性癌癥患者的血液中捕獲癌細(xì)胞。分離后，將培養(yǎng)的細(xì)胞保持15天。同一組描述了在不存在EpCAM捕獲抗體（20）的情況下支持選擇素介導(dǎo)的活性CTC捕獲的固定表面活性劑 - 納米管復(fù)合物，其允許經(jīng)歷上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化的CTC的EpCAM非依賴性捕獲。

檢測有活性CTC的方法

      許多研究表明癌癥患者可以同時存在凋亡和活的CTC（1）。因為只有可行的CTC可以有助于轉(zhuǎn)移進展，因此識別CTC的這個子集是很重要的。一種方法是將細(xì)胞凋亡標(biāo)記（M30Bcl-2）引入免疫CTC測定，如CellSearch系統(tǒng)（21,22）。令人驚訝的是，在CTC數(shù)量較多的患者中，較高的CTC細(xì)胞凋亡率與較差的預(yù)后相關(guān)，而較高的CTC Bcl-2濃度與更好的預(yù)后相關(guān)（22）。因此，將凋亡標(biāo)記物引入CTC檢測的臨床相關(guān)性仍在調(diào)查之中。

      另一種方法是使用CTC活力的功能測定。據(jù)我們所知，在數(shù)百名不同腫瘤類型的患者中使用的唯一現(xiàn)有的功能測試是EPISPOT，其允許檢測白細(xì)胞消耗富集的活的臨床相關(guān)CTC（23,24）。該技術(shù)能夠檢測EpCAM和EpCAM CTC。將細(xì)胞在包被有捕獲分泌/釋放/脫落的腫瘤相關(guān)蛋白的抗體的膜上培養(yǎng)短時間，隨后用熒光染料標(biāo)記的二次抗體檢測。對于乳腺癌，細(xì)胞角蛋白19（CK19），HER2，組織蛋白酶D和MUC-1已被用作標(biāo)記蛋白，相關(guān)的臨床資料表明CK19釋放細(xì)胞的患者有不利的結(jié)果（24,25）。對于前列腺癌，前列腺特異性抗原已被用于CTC檢測和成纖維細(xì)胞生長因子2作為干細(xì)胞生長因子用于進一步表征（26）。對于結(jié)腸癌，CK19已被用于CTC檢測（23），我們的分析表明，EPISPOT可檢測的相當(dāng)大部分活性CTC作為結(jié)腸癌患者的第一個濾器器官被捕獲在肝臟中。我們的臨床資料表明，局限性結(jié)腸癌患者和大量CTC是和不良的預(yù)后結(jié)果匹配的。在EPISPOT測定中，當(dāng)腫瘤細(xì)胞對這些藥物敏感時，免疫球蛋白的數(shù)量和強度可以降低或抑制，證明其在短時間CTC培養(yǎng)中的效率（27）。該項檢測可能被認(rèn)為是一種“癌癥編排程序”，可能有助于改善個體癌癥患者的臨床管理。

CTC的體外培養(yǎng)：細(xì)胞系的建立

      大多數(shù)癌癥患者的外周血中CTC的數(shù)量較少使得CTC的體外培養(yǎng)變得具有挑戰(zhàn)性。幾十年來，即使從數(shù)百萬腫瘤細(xì)胞開始，開發(fā)初級腫瘤或癌癥患者轉(zhuǎn)移的原代細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系也是一個挑戰(zhàn)。最近，幾個組織已經(jīng)為CTCs獲得的CTC提供了適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，這些CTCs在具有較高CTC數(shù)量的非常晚期的癌癥患者中獲得。接下來，我們討論這些發(fā)展。

      結(jié)腸癌。Cayrefourcq et al的團隊提供了從結(jié)腸癌患者的血液中分離的CTC能夠產(chǎn)生永久性細(xì)胞系的實驗證據(jù)（9）。據(jù)我們所知，沒有其他組織已經(jīng)公布了建立永久性細(xì)胞CTC系或甚至結(jié)腸癌患者的瞬時CTC培養(yǎng)物。一個原因是結(jié)腸癌患者的外周血與乳腺癌或前列腺癌患者的CTC頻率較低，使得在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)和生長CTC更加困難。

       除了建立永久性細(xì)胞系外，我們還證明，該細(xì)胞系在免疫缺陷小鼠中具有致瘤性。

       除了體外擴增2年的能力之外，CTC-MCC-41系顯示（a）具有干細(xì)胞樣特征的上皮性質(zhì)，（b）中間上皮/間質(zhì)表型，（c）快速誘導(dǎo)體外血管生成的潛力，（d）骨模擬征象，和（5）SCID小鼠的致瘤性質(zhì)。重要的是，本CTC系列共有原發(fā)腫瘤和結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的主要特征。

       前列腺癌。前列腺癌在細(xì)胞培養(yǎng)中非常難擴展，如生物庫中可用的少數(shù)細(xì)胞系所證明的。高等使用3D組織系統(tǒng)從活檢標(biāo)本和CTC（28）開發(fā)前列腺癌的長期培養(yǎng)。前7個完全表征的有機體系概括了前列腺癌亞型的分子多樣性，包括TMPRSS2-ERG融合，SPOP突變，SPINK1過表達和CHD1損失。作者建立了轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的CTC系;該報告沒有提供關(guān)于建立CTC系列成功率的任何信息，例如培養(yǎng)條件未能產(chǎn)生初級CTC培養(yǎng)物或細(xì)胞系的次數(shù)。此外，作者尚未在異種移植模型中證實其細(xì)胞系的致瘤性質(zhì)。

      乳腺癌。Zhang et al。報道了第一次建立起晚期乳腺癌患者的CTC的初級培養(yǎng)物，并提供腦轉(zhuǎn)移瘤（7）。然而，CTC不產(chǎn)生永久性細(xì)胞系，而是僅產(chǎn)生瞬時細(xì)胞培養(yǎng)物。在EpCAM CTCs中，Zhang et al團隊確定了包括“腦轉(zhuǎn)移選擇標(biāo)記”（BMSM），HER2 / EGFR / HPSE / Notch1（7）的腦轉(zhuǎn)移的潛在特征。表達BMSM特征的CTC線是高度侵襲性的，并且能夠在裸鼠中異種移植時產(chǎn)生腦和肺轉(zhuǎn)移。

      關(guān)于乳腺癌CTC培養(yǎng)物的下一篇出版物報道了從6名轉(zhuǎn)移性乳腺癌 - 亞型乳腺癌患者中分離的CTC的寡克隆CTC培養(yǎng)物（體外持續(xù)6個月）（29）。測試的5個CTC線中有3個在小鼠中是致瘤性的。 CTC系的基因組測序揭示了PIK3CA（磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞單位）中預(yù)先存在的突變和ESR1（雌激素受體1），PIK3CA和FGFR2（成纖維細(xì)胞生長因子受體2）中新獲得的突變，其他。具有多個突變的CTC系藥物敏感性檢測顯示出潛在的新治療靶點。

      肺癌。Zhang et al的團隊開發(fā)了一種新型的原位捕獲和培養(yǎng)方法，用三維共培養(yǎng)模型離體擴增CTC，模擬腫瘤微環(huán)境以支持腫瘤發(fā)育（30）。他們擴大了從19名早期肺癌患者中的14名中分離出來的CTC。擴大的肺CTC攜帶與匹配的原發(fā)性腫瘤中觀察到的相似的TP53突變（腫瘤蛋白p53）。下一代測序進一步揭示原發(fā)性腫瘤與癌癥相關(guān)基因的CTC之間的其他匹配突變。

CTC的體內(nèi)擴增：用新鮮的CTC來培養(yǎng)異種移植物

      在這里我們將討論沒有建立細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系的研究，我們將來自乳腺、前列腺和肺癌患者的血液的CTC部分富集直接注射到免疫缺陷小鼠中。異種移植前的細(xì)胞培養(yǎng)可能會影響CTC的組成; 然而，迄今為止沒有報道從新鮮分離的和培養(yǎng)的CTCs開發(fā)的異種移植物之間的直接比較。

      乳腺癌。Baccelli et al。開發(fā)了異種移植物測定法，并用它來表明原發(fā)性人乳腺癌乳腺癌CTC含有在小鼠中產(chǎn)生骨，肺和肝轉(zhuǎn)移的細(xì)胞（11）。這些CTC子集表達EpCAM，CD44，CD47和MET。在一小群轉(zhuǎn)移患者中，EpCAM CD44CD47MET CTC的數(shù)量，但不是所有的EpCAM的CTCs與較低的總生存期和增加的轉(zhuǎn)移部位數(shù)相關(guān)。該報告可能意味著具有潛在轉(zhuǎn)移起始活性的CTC的特殊子集; 然而，應(yīng)該注意的是，僅在高CTC計數(shù)的晚期階段患者中觀察到成功的異種移植。事實上，注射1000只CellSearch評估的CTCs在移植后15個月內(nèi)（n = 106）沒有導(dǎo)致人類腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移生長。相比之下，接受1109 CTC的6只受體小鼠在3例患者移植CTC后6-12個月內(nèi)發(fā)生多發(fā)性骨，肺和肝轉(zhuǎn)移。

       在2例乳腺癌患者的小型試驗研究中，Rossi等證實了CTC具有在免疫缺陷（NOD / SCID）小鼠中生長的潛力（31）。與Baccelli等人相反。 （11），他們向脛骨注射了CTC，Rossi等人皮下注射CTC。因此，反恐委員會維持其遷徙能力，兩種注射途徑似乎都適用于在乳腺癌中建立CTC異種移植物。

肺癌。大多數(shù)小細(xì)胞肺癌（SCLC）病例是不能手術(shù)的，很少可以獲得SCLC生物學(xué)檢查活檢。以前的研究表明，所有實體腫瘤患者中CLC患者的CTC計數(shù)最高，為開發(fā)功能模型提供了最佳條件（32）。 Hodgkinson等人表明來自化療敏感性或化療性SCLC患者的CTC在免疫受損的小鼠中是致瘤性的，并且所得到的CTC衍生的外植體（CDX）反映了放射性淋巴細(xì)胞反應(yīng)性和代謝性化療（10）。分離的CTC的基因組分析顯示與相應(yīng)的CDX相當(dāng)相似。來自不同臨床結(jié)果的患者的CDXs之間觀察到最明顯的差異。

      前列腺癌。Rossi等人來自轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者（n6）的分離的EpCAM CTC，在NOD / SCID小鼠中開發(fā)異種移植物測定（31）。在小鼠外周血，骨髓和脾臟中發(fā)現(xiàn)人類腫瘤細(xì)胞，這表明CTC的EpCAM陽性部分保留遷移能力。

結(jié)論

      細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的最新進展為CTC研究開辟了新的途徑，具有明顯的臨床意義。現(xiàn)在可以開發(fā)來自CTC的原代細(xì)胞培養(yǎng)物，在某些情況下，甚至已經(jīng)建立了永久細(xì)胞系。除了體外研究之外，幾組已經(jīng)能夠在注射到免疫缺陷小鼠后移植腫瘤，而第一次測試分析表明，這些模型可能是癌癥患者反應(yīng)的有用預(yù)測因子（圖1）（33）。

      需要強調(diào)的是，反恐委員會的功能分析仍處于早期的原則證明。大多數(shù)報告是基于晚期轉(zhuǎn)移期和高CTC計數(shù)的患者。然而，考慮到從數(shù)百萬個原發(fā)性腫瘤細(xì)胞建立細(xì)胞系的巨大挑戰(zhàn)，開始時，數(shù)百個CTC的細(xì)胞系或異種移植物的發(fā)展是一個主要的成就。這可以通過以下假設(shè)來解釋：可能已經(jīng)選擇了可行的CTC來獲得更好的存活和生長特性，這與已發(fā)表的報道一致，證明腫瘤細(xì)胞的傳播和彌散性腫瘤細(xì)胞和CTC的存活不是隨機過程（34,35）并且CTC細(xì)胞系和異種移植物表達癌癥干細(xì)胞性質(zhì)（9,11）。這些研究滋養(yǎng)了對CTC的深入功能分析可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)細(xì)胞的鑒定的希望。然而，為了實現(xiàn)這一重要目標(biāo)，至關(guān)重要的是將現(xiàn)有研究擴展到早期階段的患者，并將結(jié)果與轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)的發(fā)展相關(guān)聯(lián)。

      最近，液體活檢概念已經(jīng)擴展到循環(huán)的無細(xì)胞腫瘤DNA（ctDNA）（36）。我們相信，CTC和ctDNA的分析提供了不同的分析機會，因此提供了補充信息（37）。從數(shù)百萬個血細(xì)胞捕獲活的CTC當(dāng)然比從血漿或血清樣品中獲得無細(xì)胞循環(huán)DNA更費時。然而，整個腫瘤細(xì)胞的功能分析提供了通過深入的體外和體內(nèi)分析來鑒定轉(zhuǎn)移細(xì)胞的生物學(xué)特性的可能性，這為基礎(chǔ)和翻譯研究開辟了新的途徑，遠遠超出血漿中存在的片段DNA的測序。